核酸抽出は、NGSサンプル調製プロトコルの最初のステップです。核酸は、既知のあらゆる生命体に不可欠な巨大な生体分子です。核酸はヌクレオチドで構成されており、ヌクレオチドは糖、リン酸、窒素塩基の3つの成分からなるモノマーです。核酸には主にDNAとRNAの2つのクラスがあります。RNAの糖はリボースであり、DNAの糖はデオキシリボースです。
RNA（左）とDNA（右）の構造を示す図。RNAではウラシルがアデニンと対をなす塩基であり、DNAではチミンがアデニンと対をなす塩基である。画像提供：Wikipedia
核酸抽出の種類
グアニジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出
核酸の細胞構造を破壊した後、DNaseとRNaseを用いて細胞内のヌクレアーゼを不活性化します。これにより、目的の核酸を細胞残渣から分離することができます。
フェノールは単独では可燃性、腐食性、毒性のある石炭酸です。しかし、フェノール、クロロホルム、少量のイソアミルを混合することでDNA抽出が可能です。フェノールとクロロホルムをサンプルに加えると、親水性の性質により、DNA層を上部に含むエマルジョンが形成されます。その後、DNAを回収し、遠心分離で沈殿させます。得られたDNAペレットは滅菌水で溶解できます。
フェノール・クロロホルム抽出の手順を示す図。フェノール・クロロホルム混合物を細胞溶解液に加え、遠心分離した後、水で洗浄することで単離DNAを得る。画像提供：エヴァ・メザロス、2021年
グアニジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルム法を用いることで、RNAをワンステップで抽出できます。抽出後、グアニジニウムチオシアネート、酢酸ナトリウム、フェノール、クロロホルムからなる酸性溶液を用いてRNAをDNAから分離します。RNAの回収はイソプロパノール沈殿によって行われます。この沈殿により酸性状態が作られ、RNAは混合物の上部に留まります。
塩化セシウム/臭化エチジウム勾配遠心分離
塩化セシウム/臭化エチジウム勾配遠心分離法は、1950 年以来研究室で使用されてきました。この方法は、セシウムイオンと水の密度の違いと、臭化エチジウムの挿入を利用して、DNA の複製、転写、修復、および組み換えを妨害します。
この勾配遠心分離法は、他の分離プロトコルと比較して複雑で、費用と時間がかかります。大量のサンプルを必要とするため、すべての種類のシーケンシングに適しているわけではありません。また、臭化エチジウムは有害です。そのため、この方法は限界があるため、臨床検査室では使用されていません。
固相抽出
固相核酸精製は、現在市販されているほとんどの抽出キットに含まれています。通常、スピンカラムを用いて遠心力で操作することで、DNAを迅速かつ効率的に精製します。カラムはまずサンプルを吸着させるためのコンディショニングを行う必要があり、これは特定のpHの緩衝液を用いて行うことができます。細胞を破砕した後、目的の核酸は結合溶液のpHによってカラムに吸着されます。その後、競合試薬で洗浄することで夾雑物を除去し、水を加えることで目的の核酸をカラムから遊離させます。
磁気ビーズを用いた精製
磁気分離は現在、核酸精製において簡便かつ効率的な方法とみなされています。これは固相抽出法を改良したものです。ビーズは負の表面電荷を持ち、DNAなどのタンパク質に選択的に結合します。チューブの側面に磁石を当てることで、粒子が壁際に集まり、結合プロセスが促進される場合もあります。細胞残渣や不要な物質を含む残りのサンプルは、その後、注ぎ出すことができます。核酸は緩衝液によって磁性粒子から除去され、残留する不純物は洗い流されます。
磁気ビーズを用いた精製プロトコルを示す図。画像提供：アンドリュー・ゲイン、2019
この方法には確かに利点があります。繰り返しの遠心分離、真空濾過、カラム分離を必要としないため、時間とコスト効率に優れています。市販のキットも数多く販売されており、中には磁気ビーズとシリカゲルなどの他の固相抽出法を組み合わせているメーカーもあります。こうした技術は、少量のサンプルでDNA回収率を向上させることで、科学者の助けとなっています。
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